BIOTECNOLOGÍA
Bosques Naturales utiliza planta clonal para uso forestal en sus plantaciones. Para ello ha tenido que desarrollar un proceso de selección de árboles singulares y desarrollar un protocolo de micropropagación con elevados índices de éxito. Bosques Naturales realizó sus primeras plantaciones con material base, principalmente las especies cerezo (Prunus avium) y nogal híbrido (Juglans major-MJ209-x Juglans regia). A partir de ellas comenzó un proceso de selección buscando aquellos ejemplares singulares que destacasen sobre el resto en cuanto a crecimiento, forma, aprovechamiento, calidad de la madera, características fenológicas y resistencia a patógenos. En paralelo ha desarrollado un proceso de reproducción clonal mediante micropropagación.
La selección realizada en el campo es posteriormente validada mediante ensayos clonales en distintas calidades de estación. En la actualidad existe una red de ensayos distribuida por Granada, Toledo y Galicia. El objetivo de estos ensayos es comprobar el comportamiento de los clones seleccionados, así como profundizar en su manejo. Este es un paso previo y necesario para el establecimiento de plantaciones (bosques plantados) en distintas calidades de estación y convertirlas en una actividad rentable, comprometida con el medio ambiente y el desarrollo rural.
Más informaciónPROCESO DE SELECCIÓN
El material que se selecciona proviene de las plantaciones que posee la empresa Bosques Naturales en Gerona y Cáceres, la procedencia del material es de semilla de la progenie Mj209xRa, adquirido en el sur de Francia.
La progenie Mj209xRA inicialmente se le consideró un J. nigra, posteriormente se le clasificó como J. major y en la actualidad se tiende a pensar que el progenitor femenino es, él mismo, un híbrido, pero con capacidad productiva. Es una de las progenies más plantadas en España y está demostrando una gran capacidad de adaptación a zonas de suelos alcalinos y a áreas cálidas de la Península Ibérica (Neus Aletà i Soler, 2006).
Desde el año 2006, varias decenas de genotipos, tanto de nogal como de cerezo, han sido establecidos exitosamente in vitro. En la actualidad, nuestra Unidad de Cultivo de Tejidos Vegetales (UCT) dispone de 16 genotipos de nogal y 4 de cerezo. Como parte del proceso de optimización del protocolo de micropropagación de nogal, se ha producido planta clonal de 14 clones en los últimos 4 años, los que han sido utilizados para el establecimiento de nuevas plantaciones, así como para los distintos ensayos de adaptabilidad.
En estos momentos, Bosques Naturales tiene registrados 2 clones de nogal y 3 más se encuentran en proceso. Estos materiales destacan no solo por su crecimiento sino también por poseer una buena forma. Los ensayos clonales han puesto de manifiesto crecimientos promedios anuales en altura de más de 1 m durante los 3 primeros años de establecidos. Igualmente, su comportamiento en cuanto a arquitectura y rectitud del tronco han demostrado que el proceso de selección está bien encausado.
DASOMETRÍA Y FORMA DEL FUSTE
Sobre los árboles seleccionados se miden una serie de variables:
Altura del árbol: Se utiliza el hipsómetro.
Altura del fuste (que es el tronco libre de ramas): Se utiliza el hipsómetro.
Diámetro normal: Medimos con cinta Pí meter (cinta diamétrica o circómetro).
Porcentaje de incremento respecto a la media del rodal: Cálculo respecto a la media obtenida de la población dasométrica del sector en el que se ubica el árbol.
Forma y curvatura del árbol: en función de la prueba de McDonald-Kreitman.
Ángulo de inserción de ramas: Estimación del ángulo que forma la rama con el fuste.
CALIDAD DE LA MADERA
La madera es un material heterogéneo, altamente variable y anisotrópico (que posee propiedades físicas distintas según la dirección en que se mide) originado a partir del cámbium, el tejido vegetal entre la corteza y el leño. Esta variabilidad, que permite que sea utilizada en múltiples usos, puede ser una desventaja si se tiene en cuenta que la industria requiere materia prima uniforme para la elaboración de productos de calidad homogénea.
Entre los principales atributos de calidad de la madera para chapa están: la ausencia de nudos, la uniformidad del color, homogeneidad del ancho de los anillos, médula centrada y que no exista acumulación de metales en las traqueidas, que son las células conductoras del xilema, que es el tejido vegetal lignificado (Cassens, 1992). La presencia de curvatura suele estar relacionada con tensiones de crecimiento en la troza, lo que ocasionará ondulaciones sobre la chapa, pudiendo además aparecer madera de tensión que, según algunos autores, puede estar ligada a la aparición de variaciones de color en la madera (Polge, 1986).
Los criterios de calidad sólo se pueden aplicar para especificar el propósito para el cual se utiliza la madera. El principal objetivo de esta acción es aumentar el conocimiento del crecimiento de los árboles de especies de frondosas, con un énfasis en la producción de madera valiosa y con la intención de promover otros productos madereros que pueden producirse en conjunción con el principal producto (chapa de calidad).
El crecimiento es el primer parámetro que determinará la rentabilidad de la masa forestal, así como variables de forma como la conicidad, pero también las características de ramificación. El crecimiento y las variables de ramificación están directamente influenciados por la selvicultura realizada y podrá optimizarse con una correcta gestión de la calidad de estación (buena elección del sitio y aporte de nutrientes y riego) y gestionando correctamente la densidad de plantación y las podas para optimizar la emisión y cicatrización de ramas.
La conicidad del fuste, la ovalidad o elipticidad condicionan el rendimiento en chapa y por lo tanto, se prefiere un fuste cilíndrico.
Las variables intrínsecas de la madera van a determinar las características físico-mecánicas y estéticas y la homogeneidad de ésta dentro del fuste. Es aceptado que, entre las propiedades físicas, la densidad es el atributo universalmente utilizado como índice de calidad de madera en relación a sus usos. Además, está correlacionada con la mayoría de las propiedades físico-mecánicas.
En los trabajos realizados se han utilizado, entre otros, métodos de ensayo no destructivos – técnicas de evaluación no destructivas (TND)-, que se son técnicas que permiten examinar los materiales sin que se vean afectadas sus propiedades, su integridad y su utilidad final. Los retardos de la velocidad de una onda de sonido dentro del fuste dependen esencialmente de las características de la pared celular: microestructura, inclinación de las fibras respecto a la dirección de medida, humedad y singularidades o defectos en la madera.
FENOLOGÍA
La fenología es el estudio de los fenómenos biológicos en relación con el clima y cambios estacionales. Hemos utilizado un gran número de caracteres para la descripción de las características fenológicas de los árboles. Las características fenológicas nos permiten optimizar la selección del ejemplar para distintas calidades de estación, buscando brotaciones tardías que eviten pérdidas de guías por congelación y buscando resistencias a distintos tipos de estrés medioambiental.
Los marcadores son señales que se utilizan para caracterizar y diferenciar a los organismos. Son de gran utilidad en los procesos de selección y protección de nuevas variedades. Existen dos tipos básicos de marcadores, los fenotípicos y los genéticos. Los primeros están sujetos a las variaciones ambientales, mientras que los genéticos utilizan patrones de ADN y, por tanto, resultan invariables, ofreciendo una mayor seguridad en la caracterización.
Para Bosques Naturales, involucrada en un proceso de selección de variedades específicas para madera, era imprescindible disponer de una batería de marcadores de ADN, que de una forma unívoca permitiera conocer los perfiles genéticos de los árboles seleccionados. A pesar de que existen muchas pruebas basadas en el ADN, decidimos utilizar marcadores del tipo microsatélites, los cuales por su sencillez, reproducibilidad y costes asequibles ofrecían el máximo de garantías en el trazado de los perfiles genéticos de nuestros árboles “Plus”. Esta fue una tarea que desarrollamos en colaboración con la Escuela Técnica Superior de Ingenieros de Montes (UPM).
El desarrollo de esta tarea se hizo para ambas especies, sin embargo, su ejecución fue mucho más compleja en el caso del nogal. Para el cerezo bastó con hacer una revisión en la literatura científica y con los marcadores seleccionados fuimos capaces de genotipificar los árboles seleccionados. En nogal, a diferencia del cerezo, solo existía una batería de marcadores microsatélites disponibles, sin embargo, su capacidad de diferenciar en nuestra población fue escasa, por lo que fue necesario crear marcadores específicos para el híbrido maderero.
Por su envergadura fue un trabajo extremadamente laborioso y complicado, solo al alcance de pocas empresas en el mundo. Finalmente, se diseñó una batería de marcadores capaces de diferenciar entre la población del hibrido maderero, formada por medios hermanos, con una probabilidad de error muy baja.
La culminación de este proyecto nos posiciona a la vanguardia mundial en este campo. Se debe tener en cuenta que sólo existen publicadas hasta la fecha dos bibliotecas genómicas enriquecidas en microsatélites: una, resultado de la colaboración entre la Universidad de Purdue y la Universidad de California (ambas en EE.UU.) y la otra liderada por la Universidad Forestal de Beijing (China) y con participación de la Academia Forestal de China.
Los árboles seleccionados en base a las características anteriores fueron introducidos in vitro, disponiendo de una reserva actual de germoplasma que está formada por 16 genotipos diferentes de nogal y 4 de cerezo.
Como material de partida se utilizaron brotes epicórmicos (también conocidos como chupones, que son ramas verticales que crecen rápidamente desde el tronco o las raíces de un árbol). Se siguió como criterios básicos que éstos no poseyeran daños mecánicos ni ningún otro tipo de afección visible y que portaran yemas vegetativas. Una vez en nuestro laboratorio, se eliminaron los restos visibles de materiales extraños y se lavaron profusamente con agua corriente y detergente para remover las partículas más pequeñas. A continuación, los segmentos de ramas (varetas) se trataron durante 15 minutos con una solución antifúngica de Previcur (Propamocarb clorhidrato 60,5% p/v, Bayer CropScience) al (0.5%). Después del tratamiento con fungicida, las varetas fueron sumergidas en agua.
El material fue incubado en una cámara de cultivo, utilizando un fotoperíodo de 16 horas de luz con intensidades variables y 8 horas de oscuridad. Para facilitar la brotación, junto con el fotoperíodo, se utilizó también un gradiente de temperatura. Tras el comienzo de la brotación se escogieron aquellos brotes que poseían más de 20 mm de longitud. Después de quitar las hojas se sumergieron 20 minutos en una solución de NaOCl al 1%.
Por último, fueron enjuagados y se dejaron reposar en agua hasta el momento de la inoculación. Para ambos métodos se utilizó el medio de cultivo DKW-C. Los explantes o explantos (fragmentos de un tejido extraído de un ser vivo para cultivarlo en un medio artificial) fueron inoculados en tubos de ensayo que contenían 10 ml de medio de cultivo.
Aquellos explantes que mostraron un crecimiento activo fueron testados para la presencia de endófitos (microorganismos) activos. El éxito del establecimiento es genotipo-dependiente, siendo así la duración de éste es muy variable, pudiendo demorar hasta 26 meses para los árboles más recalcitrantes.
Fases de micropropagación
Preparación y recolección
FASE 0
Recolección de muestras y preparación para el inicio del cultivo in vitro. Aunque pudiera parecer una labor rutinaria, gran parte del resultado de las etapas siguientes depende de la elección adecuada del material inicial. Es nuestro caso, evidentemente, el genotipo viene determinado por los resultados del programa de selección. Elegir material rejuvenecido, vigoroso y sin daños aparentes suele ser considerado criterio de éxito durante la fase 0.
Establecimiento in vitro
FASE 1
Al ser inoculados los segmentos de plantas en medios de cultivo nutritivos y esterilizados, tienen que someterse a un proceso previo en el cual tienen que ser eliminados los microorganismos acompañantes. Este es un momento crítico, sobre todo para los nogales. Aquí se trata de encontrar un equilibrio entre el proceso de desinfección y causar el menor daño posible al material vegetal. En el caso del nogal, esta es una fase, al igual que el resto, que posee un determinismo genético muy elevado, razón principal por la que muy pocos individuos son establecidos exitosamente con un mismo protocolo.
Proliferación
FASE 2
El objetivo fundamental de esta fase es producir un volumen suficiente de propágulo, que es la parte de un organismo (planta, hongo o bacteria) capaz de desarrollarse de manera separada para dar lugar a un nuevo organismo idéntico al que lo formó. Dentro de todo el esquema de micropropagación, la proliferación es la menos exigente de las etapas. Además de lograr el incremento del volumen de material a reproducir, el mayor reto consistirá en producir microbrotes de calidad, potencialmente enraizables y con posibilidades de sobrevivir. Para el nogal, el subcultivo antes al inicio del enraizamiento es determinante, exigiendo un manejo muy preciso.
Enraizamiento
FASE 3
Como indica su nombre, el propósito de esta etapa es estimular y favorecer la formación de las raíces. En el cerezo esta etapa puede ser llevada a cabo en el invernadero. Para el nogal esta fase es uno de los momentos más complicados ya que, debido a su elevada recalcitrancia, todo el proceso tiene que ser realizado in vitro. Otro elemento que contribuye a aumentar la complejidad de esta fase es el factor genotípico. Aplicando el mismo procedimiento, el éxito del enraizamiento puede oscilar entre el 0 y casi el 100%, dependiendo de clon con que se trabaje.
Aclimatación
FASE 4
Esta fase se realiza fuera del laboratorio. Su éxito depende básicamente de los resultados alcanzados con el enraizamiento. Aunque también posee una componente genética elevada, haciendo un manejo adecuado de las condiciones climáticas, especialmente durante las primeras 5 semanas, se pueden alcanzar buenos resultados.
Plantación clonal
FASE 5
Una vez que hemos desarrollado la capacidad de reproducción nuestras selecciones, las vitroplantas producidas estarían en condiciones de ser plantadas. Producimos varios formatos de plantación y su manejo dependerá del estado de endurecimiento de la planta.
Bosques Naturales ha invertido 10 años de investigación para el desarrollo de una tecnología de reproducción masiva in vitro.
LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN
Micropropagación
Contar con protocolos eficientes de micropropagación permite a Bosques Naturales reproducir con rapidez el material vegetal élite, procedente de su programa de selección y mejora. Las elevadas tasas de multiplicación permiten disponer en un período relativamente corto de tiempo del material necesario para la plantación extensiva de nuevos clones, ya sea para la experimentación o para la explotación comercial.
Prioridades:
- Mejorar la efectividad y la eficiencia de la introducción in vitro
- Mejorar la calidad de los microbrotes
- Incrementar los porcentajes de enraizamiento
- Reducir la mortalidad durante la aclimatación
Portainjertos
Un portainjerto, también denominado patrón o pie, es la planta que recibe un injerto de otra. Los portainjertos deben poseer 3 características básicas:
(1) Ser compatibles con la variedad que se desea injertar
(2) Ser rústicos, es decir, resistentes a plagas (fundamentalmente hongos y bacterias del suelo, virus y nemátodos, entre otros) y a factores abióticos (salinidad y/o sequía, entre los más importantes)
(3) Ser vigorosos
Este constituye un mercado potencial bastante promisorio, pues son pocos los genotipos conocidos como patrones de injertos para nogal. Desarrollar una línea alternativa podría constituir una excelente oportunidad para BOSQUES NATURALES. A diferencia de las selecciones para madera, donde la forma y la calidad de la madera suponen barreras que limitan la utilidad de la población de semilla, en el caso de desarrollar patrones para frutales, tendríamos una gran población que muestrear, formada por más de 60.000 árboles genéticamente diferentes, donde cada uno podría convertirse en un patrón comercial. El hecho de poseer una progenie que expresa un alto vigor híbrido y de disponer de una tecnología funcional de micropropagación facilitaría sobremanera la evaluación y reproducción acelerada de los árboles candidatos. Este mismo principio podría ser aplicado al cerezo, con lo que se revalorizaría su importancia para la empresa.
Ensayo de clones
Estos tienen como objetivo concluir el proceso de mejoramiento que comenzó con la selección de los árboles Plus. Los ensayos deben ser establecidos en localidades con condiciones de suelo y clima contrastantes, lo que nos permitirá conocer la adaptabilidad de cada clon y poder hacer recomendaciones sobre las mejores zonas de cultivo para cada uno.
Resultados:
En 2013 pusimos en marcha la primera serie de 3 ensayos clonales en nuestra finca La Mota (Galicia). Al siguiente año se establecieron 2 nuevos ensayos en Granada y en nuestra finca de El Soto (Toledo). Los experimentos han sido montados bajo un diseño genético-estadístico que dará soporte científico a las conclusiones que se deriven de ellos.
Conservación
Las biotecnologías permiten almacenar germoplasma con mucha más eficiencia que ninguna otra técnica. El cultivo de tejidos vegetales es una forma de conservar ex situ (fuera de sus hábitats naturales) la diversidad genética a corto y a medio plazo. Sin embargo, siempre es deseable el empleo de la crioconservación, con la que se reducen los riesgos de pérdidas. Hemos logrado mantener microbrotes de nogal a bajas temperaturas durante tres meses. Seguimos profundizando en el acondicionamiento del material vegetal antes y después del tratamiento con bajas temperaturas.
Regeneración de brotes
Disponer de un protocolo de regeneración de brotes a partir de material asexual (hojas) resulta de vital importancia pues permitiría mejorar la eficiencia de la reproducción y disminuir el coste por vitroplantas. Además, abre un sinnúmero de aplicaciones en el campo del mejoramiento genético y de la producción de metabolitos secundarios, que son compuestos químicos sintetizados por las plantas que cumplen funciones no esenciales. En el caso del cerezo hemos logrado por organogénesis directa regenerar brotes y producir plantas a partir de hojas. En el del nogal, aunque se ha hecho un gran avance al lograr inducir callos y regenerar raíces también de hojas, los resultados todavía no son los esperados, necesitando profundizar más en mejorar la conversión del proceso hacia la producción de brotes.
Nuevas especies
Existen otras especies, como el roble, que por su potencial maderero también son objetivo de la empresa. Las evaluaciones en fincas experimentales han permitido determinar la existencia de árboles Plus con potencial para su explotación.
Adrenomedulina
Dentro de la línea de mejorar la eficiencia de la micropropagación se encuentra el empleo de nuevas sustancias reguladoras del crecimiento. Nuestro interés en la adrenomedulina (ADM o AM), que es una hormona péptida de efecto vasodilatador, es que podría actuar como modulador de la morfogénesis (el proceso biológico que lleva a que un organismo desarrolle su forma).
Inmersión temporal
Los sistemas de inmersión temporal (TIS) son sistemas de cultivo semiautomatizados que, además de mejorar la productividad, son apreciados especialmente por mejorar el comportamiento in vitro de los cultivos, lo que redunda en un incremento de la calidad de las vitroplantas producidas y en la disminución de la mortalidad durante la aclimatación. Hemos logrado obtener cultivos viables de nogal con los TIS, lo que probablemente constituya el primer reporte a nivel internacional en esta especie. También se han alcanzado excelentes resultados con el cerezo. Sin embargo, para su utilización a gran escala todavía, nos exige profundizar en algunos aspectos importantes. Hemos probado desde sistemas diseñados en nuestra UCT (unidad de cultivos de tejidos) y con biorreactores industriales.
Micorrización
El objetivo de este ensayo era conocer la influencia del uso de hongos micorrícicos sobre la supervivencia del nogal en la fase de aclimatación. Con tal fin, vitroplantas de 2 genotipos fueron inoculadas con una solución conteniendo esporas de la micorriza. Al término de la cuarta semana de iniciada la aclimatación, se evaluó la mortalidad, comprobándose que ésta era mucho menor entre las plantas tratadas, independientemente del clon. Estos resultados suponen un avance importante hacia el escalado comercial de la micropropagación del nogal.
TRABAJOS REALIZADOS
Artículos, publicaciones y conferencias
“Towards scaling-up the micropropagation of Juglans major (Torrey) Heller var. 209 x J. regia L., a hybrid walnut of commercial interest”. Proceedings of the IUFRO Working Party 2.09.02 conference “Integrating vegetative propagation, biotechnologies and genetic improvement for tree production and sustainable forest management”. June 25-28, 2012. Brno, Czech Republic
“Improvement and assessment of a micropropagation protocol for walnut hybrid (Juglans major var. 209 (Torrey) Heller x J. regia L.)”. VIII International Symposium on In Vitro Culture and Horticultural Breeding. 2-7, June 2013. Coimbra, Portugal.
Biotechnological Approaches for Walnut Wood Production”. Woody Plant Production Integrating Genetic and Vegetative Propagation Technologies. 8 – 12, September, 2014 Vitoria-Gasteiz, Spain
“Influence of some factors on shoot regeneration from genotypes of Prunus avium L. for wood production belonging to Bosques Naturales S. A.” Workshop “SUSTAINABLE FOREST MANAGEMENT: GENOMIC AND BIOTECHNOLOGICAL RESOURCES” 28th to 30th September 2009. Baeza, Spain
“Characterization of walnut hybrid plus trees for good quality wood plantations” International Scientific Conference on Hardwood Processing ISCHP13
“Crecimiento, forma y calidad de madera en clones de cerezo y nogal. Estudio clonal y ambiental y uso de métodos nos destructivos para su evaluación” 6º Congreso Forestal Español
“Clonal effect on rooting and acclimation rates for in-vitro micropropagation in hybrid walnut (Juglans x intermedia Mj 209): preliminary observations” Crea Journals 07/02/2020
“New set of microsatellite markers for the walnut hybrid progeny Mj209xRa and assessment of its transferability into Juglans genus” INIA Forest Systems Vol28, No 2 (2019)
UNIDAD DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
En la actualidad, el banco de germoplasma in vitro de Bosques Naturales está compuesto por 16 genotipos de nogal híbrido y 4 de cerezo, correspondientes a las selecciones realizadas en campo.
Las tareas de investigación en esta etapa se asocian al aumento de la eficiencia en las siguientes áreas:
- Introducción y conservación de los genotipos de las especies forestales de interés para la empresa.
- Optimización y mejoramiento de la eficiencia del protocolo de micropropagación de nogal.
- Empleo de técnicas avanzadas de micropropagación (empleo de sistemas de inmersión temporal o TIS).
- Escalado comercial de micropropagación del nogal.
Nuestra UCT posee el equipamiento necesario para desarrollar actividades investigativas en el cultivo in vitro. Está integrada por, entre los más importantes: balanzas de hasta 0.1 mg de precisión Sartorius, pH metro, desionizador de agua ultrapura Millipore, autoclave automático, cabina de flujo laminar biplaza Tesltar, estereomicroscopio con cámara fotográfica integrada Leica, estufa, cámara de cultivo visitable de 12 m² y con capacidad de almacenamiento de más de 20.000 plantas, dos cámaras de cultivo herméticas con control de iluminación y temperatura con capacidad para 1.600 plantas Sanyo, micropipetas de precisión Eppendorf, dispensadores de medio de cultivo, instalaciones para el funcionamiento de TIS, termodesinfectadora con capacidad de esterilización de hasta 70 frascos por turno de lavado Miele.
